Blog
Absorbans Ölçümleri – Numune Konsantrasyonunu Belirlemenin Hızlı Yolu
Tıbbi teşhislerin yanı sıra moleküler ve biyokimyasal uygulamalarda çözeltideki maddelerin konsantrasyonlarının belirlenmesi çok önemli bir analiz adımıdır. Kolay ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebildiğinden ve çoğu zaman en uygun maliyetli seçeneği temsil ettiğinden, bu amaç için sıklıkla fotometrik yöntemler kullanılır.
(Spektro)-fotometrik yöntemler genel olarak çözeltideki moleküllerin ışığı absorbe etmesi ve bu sayede zayıflayan ışığın bir dedektör yardımıyla ölçülmesi prensibine dayanır. Adından da anlaşılacağı gibi UV/Vis spektrofotometreleri, yaklaşık 200 ila 900 nm dalga boyu aralığında görünür ve ultraviyole ışık kullanır.
Bir analitin konsantrasyonunu belirlemek için çoğunlukla molekülün en yüksek absorbansı (tepe dalga boyu) gösterdiği dalga boyu kullanılır. Örneğin nükleik asitler ve proteinler durumunda bu sırasıyla 260 nm ve 280 nm olacaktır. Lambert-Beer yasasıyla açıklanan fizik yasaları, bir maddenin konsantrasyonunun fotometrik ölçümlerden hesaplanmasının temelini oluşturur. Bu, aşağıda listelenen formüllerin adımlarına göre gerçekleşir:
- İletim veya geçirgenlik (T) = I/I 0
İletim, bir fotometrede, numuneden çıkan ışık ile numuneye giren ışık arasındaki oran kullanılarak belirlenir. - Absorbans (A) = log (I 0 /I)
Absorbans, iletimin negatif onlu logaritmasından hesaplanır. - Absorbans (A) = C x L x Ɛ => Konsantrasyon (C) = A/(L x Ɛ)
Lambert-Beer yasası absorbansın numunenin konsantrasyonuna (C) bağımlılığını, optik yol uzunluğunu ( L) ve ayrıca belirli bir dalga boyundaki belirli bir maddeye ilişkin numuneye özgü bir sönme katsayısına (ɐ) bağımlılık. Numune konsantrasyonu daha sonra formülün dönüştürülmesiyle hesaplanır.
Bu üç ifade aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
İletimin belirlenmesi (T = I/I 0 )
Şekil 1: Lambert-Beer yasasıyla ilgili numuneyi ve parametreleri gösteren bir fotometrenin basitleştirilmiş montajı
I 0 : Numuneye giren ışık
I: Numuneden çıkan ışık
C: Numunenin konsantrasyonu
L: Işık yolu/numunenin kalınlığı
ɐ: Sönme katsayısı
Temel olarak bir fotometre bir ışık kaynağından, numuneyi tutan bir konumdan ve bir detektörden oluşur (Şekil 1). Dedektör numuneden geçen ışığın yoğunluğunu ölçer. Doğal olarak bir dizi başka bileşen de mevcuttur; özellikle ışığı kıran ve onu bireysel dalga boylarına ayıran optik elemanların yanı sıra ışığı yansıtan veya ileten elemanlar.
Bir fotometrenin ışık kaynağı, numune çözeltisi boyunca yönlendirilen tanımlanmış bir I0 yoğunluğunda ışık yayar. Işığın bir kısmı numune tarafından emilecektir. Numuneyi geçen kısım, dedektör tarafından yoğunluk I olarak kaydedilir. I/Io oranı, numunenin tanımlanmış bir dalga boyunda iletimini tanımlar.
Absorbansın hesaplanması (A = log (I0 /I)
Modern fotometreler, bir numunenin iletimini otomatik olarak, iletimin negatif onlu logaritması olarak tanımlanan absorbansa dönüştürür. Numune konsantrasyonunun hesaplanmasında iletimin neden doğrudan kullanılmadığı sorusu ortaya çıkıyor. Şekil 2 iletim ve absorbans arasındaki bağlantıyı açıklamaktadır. Her biri numuneye giren ışığın %50'sinin geçmesine izin veren birkaç numune seri olarak bağlanırsa, aşağıda gösterilen üstel olarak azalan iletim eğrisi ortaya çıkacaktır. Değerler bunun yerine logaritmik bir biçimde ifade edilirse doğrusal bir bağımlılık ortaya çıkar. Bu şekilde absorbans konsantrasyonla (aynı zamanda yol uzunluğuyla) orantılıdır ve bu da hesaplamaları önemli ölçüde basitleştirir.
Şekil 2: Işığın iletimi ve emilimi arasındaki bağlantı:
a) Her biri numuneye giren ışığın %50'sinin iletilmesine izin veren numunelerin seri bağlanması. Yüzde başlangıçtaki ışık yoğunluğuyla ilgilidir.
b) Üstel olarak azalan iletim eğrisi
c) Absorbansın grafiksel gösterimi (iletimin onluk logaritması kullanılarak)
Konsantrasyon hesaplaması (C = A/(L x Ɛ))
Bir numunenin konsantrasyonunu absorbansından çıkarmak için ek bilgi gereklidir. Fotometrik uygulamaların fiziksel temelini oluşturan Lambert-Beer kanunu, ışığın bir numune tarafından emilmesinin, numunenin konsantrasyonu ve yol uzunluğu ile doğru orantılı olduğunu açıklamaktadır. Toplamda üç parametre bir numunenin absorbans değerine katkıda bulunur: birincisi, molekülün konsantrasyonu (C); ikincisi, genellikle küvetin yol uzunluğuna eşit olan numunenin yol uzunluğu (L) . Daha sonra yok olma katsayısı (Ɛ) vardır. Yok olma katsayısı moleküle özgü fiziksel bir sabittir; belirli bir dalga boyundaki ışığı absorbe etme özelliğini açıklar. Bu malzemeye özgü sabit, nükleik asitler ve çeşitli proteinler de dahil olmak üzere bir dizi madde için bilinmektedir ve değerler ilgili literatürde yayınlanmıştır. Bu durumlarda konsantrasyon anında belirlenebilir. Ancak değer bilinmiyorsa bir kalibrasyon eğrisinin yardımına başvurmak mümkündür. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için standartlar, yani analiz edilecek maddelerin bilinen konsantrasyonlarını içeren çözeltiler gereklidir. Bunlar gerçek numuneden önce fotometrede ölçülür. Daha sonra analitin konsantrasyonu standart eğri kullanılarak hesaplanır.
